সুপেরিয়র পিসিআর ফলাফল জন্য কি প্রয়োজন

01 পরিষ্কার ল্যাবরেটরি শর্তাবলী

যেহেতু পিসিআর ডিএনএর একটি একক অণু সনাক্ত করতে সক্ষম, তাই পরীক্ষাগারে পুরাতন অবস্থার বজায় রাখা গুরুত্বপূর্ণ। সর্বদা তাজা গ্লাভস পরেন; নির্বীজিত কাচপাত্র, টিউব, এবং pipette টিপস ব্যবহার করুন; এবং কাজ শুরু করার আগে কাজ এলাকা পরিষ্কার।

টেম্পলেট ডিএনএ ছাড়া এবং এনজাইম ব্যতীত, কন্ট্রোল প্রতিক্রিয়াগুলি সর্বদা অন্তর্ভুক্ত করুন, ফলাফল সঠিক নমুনার সম্প্রসারণের কারণে নিশ্চিত হয়।

বেশিরভাগ লোকেরা তাদের নিজস্ব সমাধানগুলির সমাধানগুলি নিশ্চিত করে যা সমস্যাগুলি সমাধান করার জন্য ভাগ করা হয় না এবং কেবলমাত্র পিসিআরের জন্য মনোনীত পাইপগুলি সরানো হয়। ডিএনজে এবং আরএনজে-মুক্ত পিসিআর টিউব, এরেসোল-প্রতিরোধী ভিপেট টিপস এবং ইউভি লাইটের সাথে একটি ধূমপান হুডে কাজ করাও সমস্যাগুলিকে কমিয়ে আনার উপায়।

02 রাসায়নিক উপাদান

এছাড়াও গুরুত্বপূর্ণ গুরুত্ব হল টেমপ্লেট বিশুদ্ধতা এবং বিশুদ্ধতা (শুদ্ধ ডিএনএ) এবং প্রাইমার ডিজাইন। প্রাইমার ডিজাইন করার জন্য অনলাইন উপলব্ধ বিভিন্ন সফ্টওয়্যার প্রোগ্রাম আছে। সেরা প্রাইমার্স:

• 18 থেকে 24 বুনিয়াদি আছে
• কোন সেকেন্ডারি কাঠামো নেই (যেমন হেয়ারপিন লুপ)
• জি / সি এবং এ / টি জোড়া সুষম বিতরণ আছে
• 3 ফুট প্রান্তে একে অপরের পরিপূরক নয়
• গলন তাপমাত্রা (টিএম) প্রায় 5-10 ডিগ্রি সেলসিয়াস আননিলিং তাপমাত্রার নিচে, সাধারণত 55 এবং 65 ডিগ্রি সেলসিয়াসের মধ্যে থাকে। উভয় প্রাইমার জন্য টিএম ভাল ফলাফলের জন্য একই হতে হবে।

03 প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ: টেমপ্লেট এবং Primers

প্রতিক্রিয়া মিশ্রণের অনুপাতটি পিসিআর ফলাফলের গুণমানের উপর বিশাল প্রভাব ফেলে। টেমপ্লেট, এনজাইম, প্রাইমারস এবং নিউক্লিওটাইডগুলির সংকোচনের জন্য একটি সাধারণ সূত্র রয়েছে, তবে এটি একটি সামান্য বিট করা যেতে পারে।

সর্বোত্তম প্রাইমার সংকোচন 0.1 এবং 0.6 মাইক্রোমোলস / এল মধ্যে হয়। টেমপ্লেট পরিমাণ ডিএনএ (মানুষের, ব্যাকটেরিয়া, প্লাসমিড) উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হয়।

টেমপ্লেট খুব কম পরিমাণে, ফলাফলগুলি উন্নত করার অন্যান্য কৌশল রয়েছে, যেমন চক্র সংখ্যা বা "গরম শুরু" ব্যবহার। সর্বদা একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ প্রতিক্রিয়া সঙ্গে নতুন প্রাইমার পরীক্ষা, তারা আপনার নির্দিষ্ট পরীক্ষামূলক অবস্থার অধীনে কাজ নিশ্চিত করুন।

04 প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ: এনজাইম কার্যকলাপ

ডিএনএ পলিমারেজের পছন্দ পণ্যটির প্রতিক্রিয়া এবং গুণমানের বিশ্বস্ততাকে প্রভাবিত করে। ঐতিহ্যগত তাক পলিমেরেজ উচ্চতর বিশ্বস্ত এনজাইমগুলি দ্বারা অনেকগুলি ল্যাবগুলিতে প্রতিস্থাপিত হয়েছে (যারা কম ত্রুটিগুলি করে)।

প্রতিক্রিয়া মিশ্রণে MgCl2 এর ঘনত্ব পিসিআর ফলাফলকে প্রভাবিত করতে পারে এবং আরও তীব্র প্রতিক্রিয়াগুলিতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করতে পারে। ম্যাগনেসিয়াম কেশনটি পলিমেরেজ এনজাইম স্বীকৃতি দেয় এমন প্রকৃত সাবস্ট্রট তৈরি করতে ডএনটিপিগুলির দ্রবণীয় জটিল গঠন করে।

সমস্ত চারটি DNTPs সমান পরিমাণে পলিমেরেস ত্রুটি হার হ্রাস করতে সাহায্য করে। বেটাইন, বিএসএ, ডিটারজেন্টস, ডিএমএসও, গ্লিসারোল এবং পাইফোফোসফাটেসের মতো কিছু সংযোজক এনজাইম নির্দিষ্টকরণ বা প্রতিক্রিয়া দক্ষতা প্রভাবিত করতে পারে।

05 থার্মোমাইসার টাইপ

ল্যাবরেটরি সরঞ্জামের জন্য কেনাকাটা করার সময় মনে রাখবেন কিছু সঠিক তাপমাত্রা বজায় রাখার জন্য কিছু থার্মোসাইকারগুলি কম সঠিক।

এটি এমন একটি এলাকা যেখানে সস্তা যাওয়া দীর্ঘমেয়াদী অর্থ প্রদান করবে না যখন আপনি কোনও প্রতিক্রিয়াশীল প্রতিক্রিয়া বা প্রাইমারগুলি ব্যবহার করতে পারেন যা এনিলিং তাপমাত্রার সংকীর্ণ পরিসর প্রয়োজন।

Thin-walled প্রতিক্রিয়া টিউব আপনি thermocycler সুনির্দিষ্ট ব্র্যান্ড মাপসই পরিকল্পিত ডিজাইন ব্যবহার করা হয় এছাড়াও প্রতিক্রিয়া তাপমাত্রা অপ্টিমাইজ সাহায্য।

06 চক্র সেটিংস

প্রতিক্রিয়া চক্রের দৈর্ঘ্য, তাপমাত্রা এবং চক্রগুলির সংখ্যা, পিসিআর কতটা ভাল কাজ করবে তা নির্ধারণে সকলেই গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা রাখে। প্রাথমিক গরম করার ধাপটি অবশ্যই পুরোপুরি টেমপ্লেটটি পুরোপুরি অস্বীকার করতে যথেষ্ট পরিমাণে হওয়া উচিত এবং চক্রগুলি দ্রবীভূত ডিএনএকে নিজের থেকে পুনর্নির্মাণ থেকে আটকাতে যথেষ্ট পরিমাণে হতে হবে।

বর্ধিত ফলন আরও ২0 টি চক্রের এক্সটেনশান সময় বাড়িয়ে, আরও বেশি টেমপ্লেট বাড়ানোর জন্য কম এনজাইম সরবরাহ করতে পারে। সাধারণত, 40 টিরও কম চক্রগুলি 10 টেমপ্লেট অণুকে কমিয়ে আনতে যথেষ্ট পরিমাণে একটি ইথিডিয়াম ব্রোমাইড-স্টেইনড অ্যাগারোজ জেল দেখতে সক্ষম।